基因組學(xué)研究精選(五篇)

序言：作為思想的載體和知識(shí)的探索者，寫作是一種獨(dú)特的藝術(shù)，我們?yōu)槟鷾?zhǔn)備了不同風(fēng)格的5篇基因組學(xué)研究，期待它們能激發(fā)您的靈感。

篇1

藥物基因組學(xué)是伴隨人類基因組學(xué)研究的迅猛發(fā)展而開(kāi)辟的藥物遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，主要闡明藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物靶分子的基因多態(tài)性及藥物作用包括療效和毒副作用之間關(guān)系的學(xué)科。

基因多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。藥物效應(yīng)基因所編碼的酶、受體、離子通道作為藥物作用的靶，是藥物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵所在。基因多態(tài)性可通過(guò)藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)改變來(lái)影響物的作用。

基因多態(tài)性對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)的影響主要是通過(guò)相應(yīng)編碼的藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和生物轉(zhuǎn)化等方面。與物代謝有關(guān)的酶有很多，其中對(duì)細(xì)胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多。基因多態(tài)性對(duì)藥效動(dòng)力學(xué)的影響主要是受體蛋白編碼基因的多態(tài)性使個(gè)體對(duì)藥物敏感性發(fā)生差異。

苯二氮卓類藥與基因多態(tài)性：咪唑安定由CYP3A代謝，不同個(gè)體對(duì)咪唑安定的清除率可有五倍的差異。地西泮是由CYP2C19和CYP2D6代謝，基因的差異在臨床上可表現(xiàn)為用藥后鎮(zhèn)靜時(shí)間的延長(zhǎng)。

吸入與基因多態(tài)性：RYR1基因變異與MH密切相關(guān)，現(xiàn)在已知至少有23種不同的RYR1基因多態(tài)性與MH有關(guān)。氟烷性肝炎可能源于機(jī)體對(duì)在CYP2E1作用下產(chǎn)生的氟烷代謝產(chǎn)物的一種免疫反應(yīng)。

神經(jīng)肌肉阻滯藥與基因多態(tài)性：丁酰膽堿酯酶是水解琥珀酰膽堿和美維庫(kù)銨的酶，已發(fā)現(xiàn)該酶超過(guò)40種的基因多態(tài)性，其中最常見(jiàn)的是被稱為非典型的（A）變異體，與用藥后長(zhǎng)時(shí)間窒息有關(guān)。

鎮(zhèn)痛藥物與基因多態(tài)性：μ-阿片受體是阿片類藥的主要作用部位，常見(jiàn)的基因多態(tài)性是A118G和G2172T。可待因和曲馬多通過(guò)CYP2D6代謝。此外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因與痛覺(jué)的產(chǎn)生有關(guān)。

局部與基因多態(tài)性：羅哌卡因主要由CYP1A2和CYP3A4代謝。CYP1A2的基因多態(tài)性主要是C734T和G2964A，可能影響藥物代謝速度。

一直以來(lái)麻醉科醫(yī)生較其它專業(yè)的醫(yī)療人員更能意識(shí)到不同個(gè)體對(duì)藥物的反應(yīng)存在差異。的藥物基因組學(xué)研究將不僅更加合理的解釋藥效與不良反應(yīng)的個(gè)體差異，更重要的是在用藥前就可以根據(jù)病人的遺傳特征選擇最有效而副作用最小的藥物種類和劑型，達(dá)到真正的個(gè)體化用藥。

能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)病人對(duì)麻醉及鎮(zhèn)痛藥物的反應(yīng)，一直是廣大麻醉科醫(yī)生追求的目標(biāo)之一。若能了解藥物基因組學(xué)的基本原理，掌握用藥的個(gè)體化原則，就有可能根據(jù)病人的不同基因組學(xué)特性合理用藥，達(dá)到提高藥效，降低毒性，防止不良反應(yīng)的目的。本文對(duì)藥物基因組學(xué)的基本概念和常用的藥物基因組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、概述

二十世紀(jì)60年代對(duì)臨床麻醉過(guò)程中應(yīng)用琥珀酰膽堿后長(zhǎng)時(shí)間窒息、硫噴妥鈉誘發(fā)卟啉癥及惡性高熱等的研究促進(jìn)了藥物遺傳學(xué)（Pharmacogenetics）的形成和發(fā)展,可以說(shuō)這門學(xué)科最早的研究就是從麻醉學(xué)開(kāi)始的。

藥物基因組學(xué)(Phamacogenomics)是伴隨人類基因組學(xué)研究的迅猛發(fā)展而開(kāi)辟的藥物遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，主要闡明藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物靶分子的基因多態(tài)性及藥物作用包括療效和毒副作用之間的關(guān)系。它是以提高藥物的療效及安全性為目標(biāo)，研究影響藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、消除等個(gè)體差異的基因特性，以及基因變異所致的不同病人對(duì)藥物的不同反應(yīng)，并由此開(kāi)發(fā)新的藥物和用藥方法的科學(xué)。

1959年Vogel提出了“藥物遺傳學(xué)”,1997年Marshall提出“藥物基因組學(xué)”。藥物基因組學(xué)是藥物遺傳學(xué)的延伸和發(fā)展，兩者的研究方法和范疇有頗多相似之處，都是研究基因的遺傳變異與藥物反應(yīng)關(guān)系的學(xué)科。但藥物遺傳學(xué)主要集中于研究單基因變異，特別是藥物代謝酶基因變異對(duì)藥物作用的影響；而藥物基因組學(xué)除覆蓋藥物遺傳學(xué)研究范疇外，還包括與藥物反應(yīng)有關(guān)的所有遺傳學(xué)標(biāo)志，藥物代謝靶受體或疾病發(fā)生鏈上諸多環(huán)節(jié)，所以研究領(lǐng)域更為廣泛[1,2,3]。

二、基本概念

1．分子生物學(xué)基本概念

基因是一個(gè)遺傳密碼單位，由位于一條染色體(即一條長(zhǎng)DNA分子和與其相關(guān)的蛋白)上特定位置的一段DNA序列組成。等位基因是位于染色體單一基因座位上的、兩種或兩種以上不同形式基因中的一種。人類基因或等位基因變異最常見(jiàn)的類型是單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)。目前為止，已經(jīng)鑒定出13000000多種SNPs。突變和多態(tài)性常可互換使用，但一般來(lái)說(shuō)，突變是指低于1%的群體發(fā)生的變異，而多態(tài)性是高于1%的群體發(fā)生的變異。

2．基因多態(tài)性的命名法：

(1)數(shù)字前面的字母代表該基因座上最常見(jiàn)的核苷酸(即野生型)，而數(shù)字后的字母則代表突變的核苷酸。例如：μ阿片受體基因A118G指的是在118堿基對(duì)上的腺嘌呤核苷酸(A)被鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(G)取代，也可寫成118A/G或118A>G。

(2)對(duì)于單個(gè)基因密碼子導(dǎo)致氨基酸轉(zhuǎn)換的多態(tài)性編碼也可以用相互轉(zhuǎn)換的氨基酸的來(lái)標(biāo)記。例如：丁酰膽堿酯酶基因多態(tài)性Asp70Gly是指此蛋白質(zhì)中第70個(gè)氨基酸－甘氨酸被天冬氨酸取代。

三、藥物基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容

基因多態(tài)性是藥物基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)。藥物效應(yīng)基因所編碼的酶、受體、離子通道及基因本身作為藥物作用的靶，是藥物基因組學(xué)研究的關(guān)鍵所在。這些基因編碼蛋白大致可分為三大類:藥物代謝酶、藥物作用靶點(diǎn)、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。其中研究最為深入的是物與藥物代謝酶CYP45O酶系基因多態(tài)性的相關(guān)性[1,2,3]。

基因多態(tài)性可通過(guò)藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)改變來(lái)影響藥物作用，對(duì)于臨床較常用的、治療劑量范圍較窄的、替代藥物較少的物尤其需引起臨床重視。

（一）基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的影響

基因多態(tài)性對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)

的影響主要是通過(guò)相應(yīng)編碼的藥物代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的改變而影響藥物的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和生物轉(zhuǎn)化等方面[3,4,5,6]。

1、藥物代謝酶

與物代謝有關(guān)的酶有很多，其中對(duì)細(xì)胞色素-P450家族與丁酰膽堿酯酶的研究較多。

（1）細(xì)胞色素P-450（CYP45O）

物絕大部分在肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，參與反應(yīng)的主要酶類是由一個(gè)龐大基因家族編碼控制的細(xì)胞色素P450的氧化酶系統(tǒng)，其主要成分是細(xì)胞色素P-450（CYP45O）。CYP45O組成復(fù)雜，受基因多態(tài)性影響，稱為CYP45O基因超家族。1993年Nelson等制定出能反應(yīng)CYP45O基因超家族內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系的統(tǒng)一命名法：凡CYP45O基因表達(dá)的P450酶系的氨基酸同源性大于40%的視為同一家族（Family），以CYP后標(biāo)阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如CYP2；氨基酸同源性大于55%為同一亞族（Subfamily），在家族表達(dá)后面加一大寫字母，如CYP2D；每一亞族中的單個(gè)變化則在表達(dá)式后加上一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字，如CYP2D6。

（2）丁酰膽堿酯酶

麻醉過(guò)程中常用短效肌松劑美維庫(kù)銨和琥珀酰膽堿，其作用時(shí)限依賴于水解速度。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是水解這兩種藥物的酶，它的基因變異會(huì)使肌肉麻痹持續(xù)時(shí)間在個(gè)體間出現(xiàn)顯著差異。

2、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多態(tài)性

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白控制藥物的攝取、分布和排除。P-糖蛋白參與很多藥物的能量依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，包括一些止吐藥、鎮(zhèn)痛藥和抗心律失常藥等。P-糖蛋白由多藥耐藥基因（MDR1）編碼。不同個(gè)體間P-糖蛋白的表達(dá)差別明顯，MDR1基因的數(shù)種SNPs已經(jīng)被證實(shí)，但其對(duì)臨床麻醉的意義還不清楚。

（二）基因多態(tài)性對(duì)藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響

物的受體（藥物靶點(diǎn)）蛋白編碼基因的多態(tài)性有可能引起個(gè)體對(duì)許多藥物敏感性的差異，產(chǎn)生不同的藥物效應(yīng)和毒性反應(yīng)[7,8]。

1、藍(lán)尼定受體-1（Ryanodinereceptor-1，RYR1）

藍(lán)尼定受體-1是一種骨骼肌的鈣離子通道蛋白，參與骨骼肌的收縮過(guò)程。惡性高熱（malignanthyperthermia,MH）是一種具有家族遺傳性的、由于RYR1基因異常而導(dǎo)致RYR1存在缺陷的亞臨床肌肉病，在揮發(fā)性吸入和琥珀酰膽堿的觸發(fā)下可以出現(xiàn)骨骼肌異常高代謝狀態(tài)，以至導(dǎo)致患者死亡。

2、阿片受體

μ-阿片受體由OPRM1基因編碼，是臨床使用的大部分阿片類藥物的主要作用位點(diǎn)。OPRM1基因的多態(tài)性在啟動(dòng)子、內(nèi)含子和編碼區(qū)均有發(fā)生，可引起受體蛋白的改變。嗎啡和其它阿片類藥物與μ-受體結(jié)合而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及呼吸抑制。不同個(gè)體之間μ-阿片受體基因的表達(dá)水平有差異，對(duì)疼痛刺激的反應(yīng)也有差異，對(duì)阿片藥物的反應(yīng)也不同。

3、GABAA和NMDA受體

γ-氨基丁酸A型（GABAA）受體是遞質(zhì)門控離子通道，能夠調(diào)節(jié)多種物的效應(yīng)。GABAA受體的亞單位（α、β、γ、δ、ε和θ）的編碼基因存在多態(tài)性（尤其α和β），可能與孤獨(dú)癥、酒精依賴、癲癇及精神分裂癥有關(guān)，但尚未見(jiàn)與物敏感性有關(guān)的報(bào)道。N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體的多態(tài)性也有報(bào)道，但尚未發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的疾病。

（三）基因多態(tài)性對(duì)其它調(diào)節(jié)因子的影響

有些蛋白既不是藥物作用的直接靶點(diǎn)，也不影響藥代和藥效動(dòng)力學(xué)，但其編碼基因的多態(tài)性在某些特定情況下會(huì)改變個(gè)體對(duì)藥物的反應(yīng)。例如，載脂蛋白E基因的遺傳多態(tài)性可以影響羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑（他汀類藥物）的治療反應(yīng)。鮮紅色頭發(fā)的出現(xiàn)幾乎都是黑皮質(zhì)素-1受體（MC1R）基因突變的結(jié)果。MC1R基因敲除的老鼠對(duì)的需求量增加。先天紅發(fā)婦女對(duì)地氟醚的需要量增加，熱痛敏上升而局麻效力減弱。

四、苯二氮卓類藥與基因多態(tài)性

大多數(shù)苯二氮卓類藥經(jīng)肝臟CYP45O代謝形成極性代謝物，由膽汁或尿液排出。常用的苯二氮卓類藥物咪唑安定就是由CYP3A代謝，其代謝產(chǎn)物主要是1-羥基咪唑安定，其次是4-羥基咪唑安定。在體實(shí)驗(yàn)顯示不同個(gè)體咪唑安定的清除率可有五倍的差異。

地西泮是另一種常用的苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥，由CYP2C19和CYP2D6代謝。細(xì)胞色素CYP2C19的G681A多態(tài)性中A等位基因純合子個(gè)體與正常等位基因G純合子個(gè)體相比，地西泮的半衰期延長(zhǎng)4倍，可能是CYP2C19的代謝活性明顯降低的原因。A等位基因雜合子個(gè)體對(duì)地西泮代謝的半衰期介于兩者之間。這些基因的差異在臨床上表現(xiàn)為地西泮用藥后鎮(zhèn)靜或意識(shí)消失的時(shí)間延長(zhǎng)[9,10]。

五、吸入與基因多態(tài)性

到目前為止，吸入的藥物基因組學(xué)研究主要集中于尋找引起藥物副反應(yīng)的遺傳方面的原因，其中研究最多的是MH。藥物基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RYR1基因變異與MH密切相關(guān)，現(xiàn)在已知至少有23種不同的RYR1基因多態(tài)性與MH有關(guān)。

與MH不同，氟烷性肝炎可能源于機(jī)體對(duì)在CYP2E1作用下產(chǎn)生的氟烷代謝產(chǎn)物的一種免疫反應(yīng)，但其發(fā)生機(jī)制還不十分清楚[7,11]。

六、神經(jīng)肌肉阻滯藥與基因多態(tài)性

神經(jīng)肌肉阻滯藥如琥珀酰膽堿和美維庫(kù)銨的作用與遺傳因素密切相關(guān)。血漿中丁酰膽堿酯酶(假性膽堿酯酶)是一種水解這兩種藥物的酶，已發(fā)現(xiàn)該酶超過(guò)40種的基因多態(tài)性，其中最常見(jiàn)的是被稱為非典型的（A）變異體，其第70位發(fā)生點(diǎn)突變而導(dǎo)致一個(gè)氨基酸的改變，與應(yīng)用肌松劑后長(zhǎng)時(shí)間窒息有關(guān)。如果丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態(tài)性雜合子(單個(gè)等位基因)表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致膽堿酯酶活性降低，藥物作用時(shí)間通常會(huì)延長(zhǎng)3～8倍；而丁酰膽堿酯酶Asp70Gly多態(tài)性的純合子(2個(gè)等位基因)表達(dá)則更加延長(zhǎng)其恢復(fù)時(shí)間，比正常人增加60倍。法國(guó)的一項(xiàng)研究表明，應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）方法，16例發(fā)生過(guò)窒息延長(zhǎng)的病人中13例被檢測(cè)為A變異體陽(yáng)性。預(yù)先了解丁酰膽堿酯酶基因型的改變，避免這些藥物的應(yīng)用可以縮短術(shù)后恢復(fù)時(shí)間和降低醫(yī)療費(fèi)用[6,12]。

七、鎮(zhèn)痛藥物與基因多態(tài)性

μ-阿片受體是臨床應(yīng)用的阿片類藥的主要作用部位。5%～10%的高加索人存在兩種常見(jiàn)μ-阿片受體基因變異，即A118G和G2172T。A118G變異型使阿片藥物的鎮(zhèn)痛效力減弱。另一種阿片相關(guān)效應(yīng)—瞳孔縮小，在118G攜帶者明顯減弱。多態(tài)性還可影響阿片類藥物

的代謝。

阿片類藥物的重要的代謝酶是CYP2D6。可待因通過(guò)CYP2D6轉(zhuǎn)化為它的活性代謝產(chǎn)物－嗎啡，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。對(duì)33名曾使用過(guò)曲馬多的死者進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)，CYP2D6等位基因表達(dá)的數(shù)量與曲馬多和O－和N－去甲基曲馬多的血漿濃度比值密切相關(guān)，說(shuō)明其代謝速度受CYP2D6多態(tài)性的影響。除CYP2D6外，美沙酮的代謝還受CYP3A4的作用。已證實(shí)CYP3A4在其它阿片類藥如芬太尼、阿芬太尼和蘇芬太尼的代謝方面也發(fā)揮重要作用。

有報(bào)道顯示兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因與痛覺(jué)的產(chǎn)生有關(guān)。COMT是兒茶酚胺代謝的重要介質(zhì)，也是痛覺(jué)傳導(dǎo)通路上腎上腺素能和多巴胺能神經(jīng)的調(diào)控因子。研究證實(shí)Val158MetCOMT基因多態(tài)性可以使該酶的活性下降3～4倍。Zubieta等報(bào)道，G1947A多態(tài)性個(gè)體對(duì)實(shí)驗(yàn)性疼痛的耐受性較差，μ-阿片受體密度增加，內(nèi)源性腦啡肽水平降低[13～16]。

八、局部與基因多態(tài)性

羅哌卡因是一種新型的酰胺類局麻藥，有特有的S-(-)-S對(duì)應(yīng)體，主要經(jīng)肝臟代謝消除。羅哌卡因代謝產(chǎn)物3-OH-羅哌卡因由CYP1A2代謝生成，而4-OH-羅哌卡因、2-OH-羅哌卡因和2-6-pipecoloxylidide(PPX)則主要由CYP3A4代謝生成。CYP1A2的基因多態(tài)性主要是C734T和G2964A。Mendoza等對(duì)159例墨西哥人的DNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因的突變率為43%。Murayama等發(fā)現(xiàn)日本人中CYP1A2基因存在6種導(dǎo)致氨基酸替換的SNPs。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究、個(gè)體化用藥具有重要意義[17,18,19]。

九、總結(jié)與展望

篇2

關(guān)鍵詞：藥物基因組學(xué)；中藥；基因組技術(shù)

中圖分類號(hào)：[R932] 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2013）44-0160-02

中藥是中華民族的瑰寶，隨著生物科技的發(fā)展，我們也越來(lái)越關(guān)注運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行全面研究。基因組學(xué)是20世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的一門科學(xué)，隨著人類基因組計(jì)劃的完成及后基因組時(shí)代的到來(lái)，藥物基因組（Pharmacogenomics），即研究遺傳變異與藥物反應(yīng)相互關(guān)系的一門學(xué)科，是以提高藥物的療效和安全為目標(biāo)，已成為新的研究重點(diǎn)。藥物基因組學(xué)的發(fā)展為中藥現(xiàn)代化提供了良好契機(jī)。

一、基因組學(xué)概述

1.基因組學(xué)定義。基因組學(xué)（Genomics）是研究基因組的科學(xué)，它以分子生物學(xué)、電子計(jì)算機(jī)和信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)為研究手段，以生物體內(nèi)全部基因?yàn)檠芯繉?duì)象，在全基因組背景下和整體水平上探索生命活動(dòng)內(nèi)在規(guī)律及內(nèi)在環(huán)境對(duì)機(jī)體影響機(jī)制的科學(xué)。它從全基因組的整體水平，而不是單個(gè)水平，來(lái)研究生命這一具有自組織和自裝配特性的復(fù)雜系統(tǒng)，認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)的規(guī)律，從而將更加接近生命的本質(zhì)和面貌。

2.基因組研究?jī)?nèi)容。基因組學(xué)作為一門新興學(xué)科，根據(jù)其研究對(duì)象，研究的重點(diǎn)及研究的目的不同，又分成多分支學(xué)科。根據(jù)研究的重點(diǎn)不同，基因組學(xué)可以分為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)，結(jié)構(gòu)基因組學(xué)以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)，而功能基因組學(xué)以基因功能鑒定為目標(biāo)。根據(jù)研究的對(duì)象不同還可將基因組學(xué)分為疾病基因組學(xué)、比較基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)和環(huán)境基因組學(xué)等。基因組研究可以理解為：①基因表達(dá)概況研究，即比較不同組織和不同發(fā)育階段、正常狀態(tài)與疾病狀態(tài)，以及體外培養(yǎng)的細(xì)胞中基因表達(dá)模式的差異，技術(shù)包括傳統(tǒng)的RTPCR，RNase保護(hù)試驗(yàn)，RNA印跡雜交等。②基因產(chǎn)物-蛋白質(zhì)功能研究，包括單個(gè)基因的蛋白質(zhì)體外表達(dá)方法，以及蛋白質(zhì)組研究。③蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究，利用酵母雙雜交系統(tǒng)，單雜交系統(tǒng)（one-hybrid system），三雜交系統(tǒng)（thrdee-hybrid system）以及反向雜交系統(tǒng)（reverse hybrid system）等。

二、中藥研究中常用的基因組技術(shù)

1.基因芯片技術(shù)。基因芯片又稱DNA芯片（DNA chip）、DNA微陣列，是基于核酸、探針互補(bǔ)雜交技術(shù)原理，將大量的寡核酸片段按預(yù)先設(shè)定的排列順序固化在載體表面如硅片或玻片上，并以此為探針，在一定的條件下與樣品中的待測(cè)的靶基因片段或DNA序列雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列信息的快速檢測(cè)和分析。目前已成為基因表達(dá)分析的最常用工具。基因芯片技術(shù)具有高通量、并行、高內(nèi)涵的特點(diǎn)，這就為探索中藥作用機(jī)理開(kāi)辟了新領(lǐng)域。現(xiàn)代藥理學(xué)分子水平研究表明藥物作用都有其靶點(diǎn)，基因芯片可以確定靶組織的基因表達(dá)模式，從而將中藥作用的靶基因全部顯示出來(lái)。如陳明偉利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)中藥單體人參皂苷20（R）Rg3對(duì)腫瘤血管生長(zhǎng)調(diào)控因子（VEGF）蛋白表達(dá)的抑制作用。基因芯片技術(shù)還有助于確定中藥有效部位，通過(guò)基因芯片技術(shù)迅速篩選起作用的中藥有效成分。此外，基因芯片技術(shù)在中藥材鑒定，道地藥材篩選，中藥新藥研發(fā)等方面都有重要的應(yīng)用。

2.DNA分子標(biāo)記技術(shù)。①RAPD技術(shù)。RAPD即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，在1990年由Welsh與Williams等人發(fā)展起來(lái)，是建立在PCR（Polymerase Chain Reaction）基礎(chǔ)之上的一種可對(duì)整個(gè)未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)。其以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列（通常為10個(gè)堿基對(duì)）為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RAPD技術(shù)能快捷地辨別出不同遺傳物質(zhì)之間最微小的DNA偏差，而且耗材較少，不必提前獲知其基因堿基順序，通過(guò)對(duì)遺傳資源的分析，從遺傳多樣性中得到詳盡的遺傳信息。現(xiàn)在，RAPD技術(shù)已成功鑒定細(xì)辛、蒲公英、龍膽草、人參及西洋參等藥材。②RELP技術(shù)。RELP技術(shù)即限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)，就是將DN段用限制性內(nèi)切酶消化后，進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。RELP技術(shù)可以確定基因種屬的特異性和藥材的鑒定。陳美蘭采用PCR-RFLP方法從分子水平鑒定人參中有效成分人參皂苷的含量，克服了因人參分布易受生長(zhǎng)環(huán)境、儲(chǔ)存條件和加工等諸因素影響，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方法難以鑒別的缺點(diǎn)。

3.PCR技術(shù)。PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是體外擴(kuò)增DNA序列的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于目的基因的制備等幾乎所有的分子生物學(xué)領(lǐng)域。DNA的保存需要嚴(yán)格的條件，在正常的中藥材加工和儲(chǔ)存過(guò)程中是很難做到的。王嚴(yán)明等通過(guò)PCR技術(shù)從保存了9年的藥材龜板中提取DNA，成功進(jìn)行了DNA指紋鑒定。

4.DNA測(cè)序技術(shù)。DNA測(cè)序技術(shù)，即測(cè)定DNA序列的技術(shù)。在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。該技術(shù)包括單向測(cè)序（Single-Read Sequencing），雙向測(cè)序（Paied-End Sequencing）混合樣品測(cè)序（Indexed Sequencing）。DNA測(cè)序技術(shù)在中藥品質(zhì)研究中有重要的應(yīng)用，劉玉萍等采用PCR直接測(cè)序技術(shù)測(cè)定半夏及其偽品的18SrRNA基因核苷酸序列并作序列變異和選擇性內(nèi)切酶譜（PCR-SR）分析，為半夏正品鑒別提供分子依據(jù)。此外，該技術(shù)還可以用于中藥的品質(zhì)鑒定，仇萍等通過(guò)DNA指紋圖譜從分子水平對(duì)中藥材種質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確分析，從而為鑒定藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣提供依據(jù)。

三、展望

基因組學(xué)研究已把揭示生命本質(zhì)提高到了一個(gè)全新水平，同樣它在中藥各個(gè)領(lǐng)域的滲透也使中藥發(fā)展有了更廣闊的前景，將推動(dòng)中藥在種材培育、藥材鑒定、機(jī)理闡述和新藥研發(fā)的進(jìn)步，促進(jìn)中藥走出中國(guó)，走向世界。

參考文獻(xiàn)：

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篇3

關(guān)鍵詞： 功能基因組； 西瓜； 甜瓜； 黃瓜

功能基因組學(xué)（functional genomics），又被稱為后基因組學(xué)（post-genomics），它是利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的豐富信息和產(chǎn)物，借助高通量、大規(guī)模的試驗(yàn)分析方法，在全基因組或系統(tǒng)水平上研究基因的功能，弄清生物體中各組分是如何工作并形成有功能的細(xì)胞、組織及整個(gè)生物體[1]。其目標(biāo)是明確基因組中全部基因的功能， 揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境應(yīng)答互作的分子網(wǎng)絡(luò)， 從而全面闡釋植物的生物學(xué)基礎(chǔ)。目前，水稻、擬南芥等模式植物功能基因組學(xué)研究發(fā)展較快，近幾年隨著科技進(jìn)步和資金投入的不斷增加，葫蘆科作物基因組研究也取得了一定的成果。西瓜基因組全長(zhǎng)約425 Mb，甜瓜約450 Mb，黃瓜約376 Mb[2]， 基因組大小比較適合開(kāi)展基因組測(cè)序和功能基因組研究。2007年由西班牙牽頭組織，美國(guó)、中國(guó)、法國(guó)、以色列、日本等國(guó)家的14個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合啟動(dòng)了國(guó)際葫蘆科基因組計(jì)劃（International Cucurbit Genomics Initiative，ICuGI），該計(jì)劃為瓜類蔬菜的基因組學(xué)研究奠定了良好的技術(shù)平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上，2008年相繼啟動(dòng)了葫蘆科三大作物西瓜、甜瓜、黃瓜的全基因組測(cè)序計(jì)劃[3]。隨著基因組測(cè)序工作的陸續(xù)完成，瓜類作物基因組研究逐步進(jìn)入到功能基因組研究時(shí)代。本文綜述了近些年植物功能基因組學(xué)主要研究方法在西瓜、甜瓜以及黃瓜上的應(yīng)用概況。

1 高通量、大規(guī)模EST測(cè)序及功能解析

EST（Express Sequence Tag）是指通過(guò)對(duì)cDNA 文庫(kù)中隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的cDNA 的5’或3’端序列，長(zhǎng)度一般為150～500 bp。EST是基因編碼序列的一部分，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知功能的基因序列進(jìn)行對(duì)比，從理論上可推測(cè)其基因功能。EST已發(fā)展成為新基因發(fā)現(xiàn)的有效途徑，也是植物功能基因組學(xué)研究的重要工具。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷改良和測(cè)序成本的降低，高通量、大規(guī)模EST測(cè)序及功能解析開(kāi)始廣泛應(yīng)用。

西瓜EST研究方面，A. Levi 等[4]通過(guò)與葉片cDNA消減雜交構(gòu)建了西瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫(kù)，獲得了832條無(wú)冗余EST，序列比對(duì)分析表明有410個(gè)EST-unigenes與已知編碼蛋白的基因同源，按功能歸類分屬于初級(jí)代謝、氨基酸合成組裝、細(xì)胞膜運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、細(xì)胞壁代謝、細(xì)胞骨架和細(xì)胞形成、基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗性防御和次級(jí)代謝。這些潛在的功能基因序列為日后開(kāi)展西瓜果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成的遺傳與功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)。呂桂云等[5]通過(guò)構(gòu)建枯萎病菌誘導(dǎo)的西瓜根系組織SSH-cDNA文庫(kù)，對(duì)測(cè)序獲得的4 431條高質(zhì)量EST序列進(jìn)行聚類拼接，獲得1 756個(gè)非重復(fù)序列，基因功能分類表明抗病與防御相關(guān)基因約占36.3%，對(duì)獲得的西瓜與枯萎病非親和互作中部分特異性表達(dá)的基因進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)可能參與西瓜與枯萎病菌非親和互作的轉(zhuǎn)錄因子、激酶和防衛(wèi)基因及茉莉酸和木質(zhì)素2個(gè)主要代謝途徑。Guo等[6]采用Roche/454新一代測(cè)序技術(shù)，從西瓜4個(gè)果實(shí)發(fā)育期（授粉后10、18、26、34 d）獲得了577 023個(gè)高質(zhì)量EST，組裝成了75 068個(gè)unigenes，有54.9% 的unigenes與GeneBank中的已知基因同源，其中2/3來(lái)源于黃瓜。Gene Ontology （GO）注釋表明，有33 853個(gè)unigenes（45.1%）獲得至少1個(gè)GO術(shù)語(yǔ)，被注釋序列的基因功能分屬于分子功能（molecular function）類別、生物過(guò)程（biological process）類別和細(xì)胞組分（cellular component）類別，所占比例分別為38.6%、38.6%和36%，另外大約29%的unigenes同時(shí)具有以上3種功能分類。生物過(guò)程類別的基因主要參與細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程和生物合成過(guò)程，表明果肉組織在發(fā)育過(guò)程中發(fā)生了廣泛的代謝活動(dòng)。數(shù)字基因表達(dá)譜分析及實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證表明有3 023個(gè)基因在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期存在顯著的表達(dá)差異，表達(dá)量差異至少在2倍以上。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁相關(guān)基因在未成熟白瓤果肉組織中高效表達(dá)，而類葫蘆卜素代謝基因（八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素-β環(huán)化酶）、蔗糖代謝基因（蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶）在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期差異表達(dá)明顯，作者對(duì)與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的一些生化途徑如纖維素合成、木栓質(zhì)合成、葡萄糖合成降解以及淀粉合成降解等進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定。

甜瓜大規(guī)模EST測(cè)序及功能解析方面，Nurit Katzir等[7]通過(guò)構(gòu)建甜瓜EST數(shù)據(jù)庫(kù)，從4 800條序列中鑒定出與甜瓜果實(shí)香味代謝相關(guān)的3類基因家族，乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶、倍半萜合酶和類胡蘿卜素裂解雙加氧酶，克隆得到候選基因的全長(zhǎng)序列，研究了這些基因在不同甜瓜品種間的表達(dá)模式。Daniel Gonzalez-Ibeas等[8]通過(guò)對(duì)8個(gè)來(lái)源于甜瓜不同組織和生理狀態(tài)的cDNA文庫(kù)（包括授粉后15 d和46 d的2個(gè)果實(shí)的文庫(kù)）測(cè)序和序列拼接、組裝，獲得16 637個(gè)無(wú)冗余EST。通過(guò)與擬南芥基因組做生物信息學(xué)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)眾多個(gè)與果實(shí)發(fā)育相關(guān)的基因，如ACC合成酶、ACC氧化酶、細(xì)胞壁代謝酶、類胡蘿卜素合成代謝酶、MADS-box 基因等。實(shí)時(shí)定量PCR表明在果實(shí)成熟期乙烯受體基因EIN4表達(dá)量翻倍，表明該基因與果實(shí)成熟期乙烯信號(hào)調(diào)控相關(guān)。MADS-box 基因SVP在果實(shí)成熟期表達(dá)量下降了4倍，番茄紅素ε環(huán)化酶基因（LUT2）和木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（TCH4）表達(dá)量也下降了4倍。2011年，Christian Clepet等[9]構(gòu)建了4個(gè)不同類型甜瓜品種不同植物組織的11個(gè)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)和4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)，分別獲得71 577 條和22 179條EST，能夠組裝成24 444條unigenes，基因?qū)Ρ蕊@示有75%～85%的序列與雙子葉植物同源，70%與單子葉植物同源，有6 972個(gè)基因家族在雙子葉植物和單子葉植物間具有保守性。對(duì)數(shù)字基因表達(dá)譜研究，結(jié)果表明有175個(gè)基因?yàn)榻M織特異表達(dá)，這些基因?yàn)槲磥?lái)開(kāi)展功能基因組研究提供了寶貴的資源。作者從這些序列中鑒定出了4 068個(gè)SSR和3 073個(gè)SNP，并對(duì)1 382個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。為了解甜瓜對(duì)鹽脅迫的抗性反應(yīng)機(jī)制，Shiwei Wei等[10]構(gòu)建了耐鹽甜瓜品種根系組織的抑制消減雜交（SSH）cDNA文庫(kù)，測(cè)序獲得262條uni-ESTs，有161條序列與已知基因高度同源，128條與未知功能基因同源，有很多基因顯示與生物和非生物脅迫相關(guān)。研究表明，甜瓜耐鹽受眾多蛋白質(zhì)調(diào)控，這些蛋白涉及細(xì)胞代謝、能量、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)命運(yùn)以及細(xì)胞拯救和防御等生物過(guò)程，表明甜瓜作物耐鹽存在復(fù)雜的抗性反應(yīng)機(jī)制。

在黃瓜上面，Dae-Jae Kim[11]構(gòu)建了黃瓜子葉生長(zhǎng)不同時(shí)期的cDNA文庫(kù)，篩選出大量與衰老相關(guān)的基因，利用半定量RT-PCR分析了365個(gè)克隆，發(fā)現(xiàn)有很多基因表達(dá)量提高，這些基因有些功能已知，有些功能未知。齊曉花等[12]采用SMART 技術(shù)構(gòu)建了高抗白粉病的黃瓜品系JIN5-508 的葉片cDNA文庫(kù)，利用該文庫(kù)隨機(jī)挑選的8 352個(gè)克隆從5’端進(jìn)行單向測(cè)序，共獲得8 035個(gè)有效的ESTs，序列的平均長(zhǎng)度為838 bp。從文庫(kù)中篩選出了大量的低豐度表達(dá)基因，約占unigene總數(shù)的72.5%，1 991個(gè)unigenes 獲得分子功能注釋，其中與蛋白結(jié)合活性和催化活性相關(guān)的基因分別達(dá)到了41.34%和38.72%；在獲得功能注釋的unigene 中，有部分抗病抗逆相關(guān)基因高豐度表達(dá)，其中3個(gè)unigenes與擬南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8 和Mlo14 高度同源。盛慧等[13]利用抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）構(gòu)建黃瓜胚胎發(fā)育早期和晚期差異表達(dá)cDNA文庫(kù)，經(jīng)反向Northern blot雜交檢測(cè)，共得到97個(gè)陽(yáng)性克隆。利用分子生物學(xué)軟件對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和聚類、拼接，共得到93個(gè)Uni-ESTs，其中包括86個(gè)singletons 和7個(gè)contigs。將上述EST序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，有83個(gè)EST片段找到了與之匹配的同源序列，有10 個(gè)EST片段未找到同源序列，推測(cè)可能是新基因。其中很多EST與擬南芥、水稻或玉米蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的熱激蛋白具有很高的同源性。將以上序列進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育早期細(xì)胞防御和代謝過(guò)程占主要位置，而在胚胎發(fā)育晚期細(xì)胞防御和抗?jié)B透脅迫功能是非常重要的。Guo等[14]以黃瓜全雌系和雌雄同株系測(cè)序獲得353 941條EST，其中188 255條來(lái)源于全雌花，165 686條來(lái)源于雌雄花，結(jié)合5 600條GeneBank收錄的EST和mRNA序列，組裝成了81 401條unigenes。通過(guò)基因功能注釋和分析，預(yù)測(cè)了343個(gè)生化代謝途徑。對(duì)數(shù)字基因表達(dá)分析，表明大約200個(gè)基因在不同花性型存在差異表達(dá)，為研究植物花分化的分子機(jī)理提供了新的認(rèn)識(shí)。潘宇等[15]構(gòu)建了黃瓜授粉前后多個(gè)發(fā)育階段的幼果組織cDNA文庫(kù)，測(cè)序獲得116條EST，92.2% 的長(zhǎng)度在400 bp以上，19% 為重疊序列。在GeneBank中進(jìn)行BLAST分析后確認(rèn)與已知功能基因相似的EST序列有71條，有相似序列而功能未知的基因和沒(méi)有相似序列的EST序列各占19.83% 和18.97%。

2 TILLING技術(shù)

TILLING（targeting induced local lesions in

genomes，定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)），該技術(shù)借助高通量、標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)手段，快速有效地從經(jīng)化學(xué)誘變劑（EMS）誘變過(guò)的突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變。與傳統(tǒng)的插入突變比，TILLING技術(shù)利用傳統(tǒng)的化學(xué)誘變獲得突變體，不需要耗時(shí)的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)過(guò)程，具有高通量、低成本、高效率等諸多優(yōu)勢(shì)。目前，TILLING作為一種全新的反向遺傳學(xué)研究方法已經(jīng)用于多種植物。

TILLING技術(shù)在葫蘆科作物上的應(yīng)用主要集中在甜瓜方面，2007年，Yaakov Tadmor等[16]最先用EMS誘變構(gòu)建了甜瓜品種Noy Yizreel的突變基因庫(kù)，共產(chǎn)生3 000個(gè)M2家系，發(fā)現(xiàn)了大量新的表型突變，大部分為隱性單基因控制。Fatima Dahmani-Mardas等[17]建立了甜瓜品種Char Mono （Cucumis melo L. subsp. melo var. cantalupensis）的TILLING技術(shù)平臺(tái)，CharMono系雌雄同株、呼吸躍變型，在M2現(xiàn)了大量子葉、莖蔓、花和果實(shí)發(fā)生的表型突變，利用與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的11個(gè)基因篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)大約每隔573 kb會(huì)發(fā)生一個(gè)突變，大部分都是G/C 突變成 A/T ，也有G/C 到 C/G，T/A到 A/T和C/G到A/T的變異，外顯子測(cè)序表明31.3%為基因沉默突變，65.1%為錯(cuò)義，2.4%為轉(zhuǎn)錄終止，1.2%為拼接剪接突變，氨基環(huán)丙烷羧酸氧化酶基因CmACO1篩選到7個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)突變，其中G194D果皮顏色變異明顯，果實(shí)延遲成熟黃化，而果形、可溶性固形物含量和果肉顏色仍然與野生型一樣。G194D自交純合株系也呈現(xiàn)出果實(shí)發(fā)育期延長(zhǎng)、果肉變硬和果實(shí)延熟，并且在2個(gè)不同試驗(yàn)地點(diǎn)表現(xiàn)一致，這些表型變異證明了G194D系CmACO1基因突變而來(lái)，該研究利用TILLING技術(shù)成功創(chuàng)造了甜瓜品質(zhì)新資源，顯著提高了品種貨架期。Mireia González等[18]建立了甜瓜品種Piel de Sapo （Cucumis melo subsp. melo var. inodorus）的TILLING技術(shù)平臺(tái)，Piel de Sapo系雄全同株、非呼吸躍變型，EMS誘變得到2 368個(gè)M2家系，用病毒侵染抗性相關(guān)的2個(gè)基因Cm-eIF4E（核細(xì)胞翻譯起始因子）、eIF（iso）4E（核細(xì)胞翻譯起始因子異構(gòu)體）、4個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的基因ACO1、Cm-NOR、Cm-DET1、Cm-DHS（脫氧羧腐胺賴氨酸合酶）以及PDS（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)Cm-eIF4E等位基因突變，推測(cè)其中的2個(gè)改變了蛋白質(zhì)功能，PDS有2個(gè)等位突變，發(fā)生在外顯子的突變改變了蛋白質(zhì)功能，造成了苗期白化表型突變。4個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的基因在群體中篩選突變，得到8個(gè)突變的家系。徐美紅等[19]用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序和克隆測(cè)序2種方法用于檢測(cè)這8個(gè)突變家系的堿基變化。在直接測(cè)序中，4個(gè)突變家系的測(cè)序結(jié)果清晰，能夠確認(rèn)堿基的變化；其他4個(gè)家系的結(jié)果不清晰，不能確認(rèn)堿基的改變。在克隆測(cè)序中，8個(gè)家系的測(cè)序結(jié)果均清晰，能夠直接確定目的基因的點(diǎn)突變。在2種方法的比較中，克隆測(cè)序的準(zhǔn)確率、效率明顯優(yōu)于直接測(cè)序法。

黃瓜方面，以色列的R. Fraenkel等[20]通過(guò)EMS誘變獲得了大約1 000個(gè)M2家系，在苗期發(fā)現(xiàn)了諸如植株矮化、子葉自發(fā)病變、黃（花）葉、白化苗、葉片卷曲、窄型黑色子葉等諸多表型突變，利用PDS-3（八氫番茄紅素去飽和酶）篩選突變株系，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)突變家系，測(cè)序表明堿基突變均發(fā)生于基因內(nèi)含子區(qū)域，因此并未造成相應(yīng)的黃化表型突變。該套突變體庫(kù)為黃瓜反向遺傳學(xué)及基因功能研究奠定了很好的基礎(chǔ)。

西瓜作物TILLING技術(shù)的應(yīng)用尚未見(jiàn)正式報(bào)道，美國(guó)農(nóng)業(yè)部蔬菜研究實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家目前正在從事相關(guān)的工作，預(yù)計(jì)將很快取得進(jìn)展。

3 DNA芯片

DNA芯片是利用已知基因組序列，或來(lái)自未知序列的 cDNA 克隆制備模板 cDNA，通過(guò)人工或特定的儀器將大量模板 cDNA 按設(shè)計(jì)好的順序定量地固定在載體上制備成高密度的微陣列。將標(biāo)記好的樣品 cDNA 片段（來(lái)自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官）與模板上的cDNA 進(jìn)行分子雜交。根據(jù)不同材料間基因差異表達(dá)的信息，推論某個(gè)基因的功能或鑒定和分離目的基因。DNA 芯片還廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)譜、突變基因篩選和轉(zhuǎn)基因鑒別等方面。

在西瓜上，Levi 等[4]通過(guò)與葉片cDNA消減雜交構(gòu)建了西瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期（授粉后12、24、36 d）果肉消減cDNA文庫(kù)。為進(jìn)一步探究這些EST-unigenes在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，W. Patrick Wechter等[21]利用微列陣（microarray）技術(shù)對(duì)這些EST進(jìn)行了差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)與葉片相比，有335個(gè)ESTs的表達(dá)存在明顯的差異，表達(dá)量差異至少在2倍以上。其中有211個(gè)與已知功能基因同源，96個(gè)為未知基因。這些基因參與了維管系統(tǒng)、類胡蘿卜素合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、病原和逆境脅迫響應(yīng)以及乙烯合成等，實(shí)時(shí)定量PCR也驗(yàn)證了這些功能基因的差異表達(dá)。

在甜瓜上，張紅等[22]利用國(guó)內(nèi)首個(gè)甜瓜cDNA 芯片Melon cDNA array ver1.0檢測(cè)了新疆厚皮甜瓜（Cucumis melo var. ameri）果實(shí)基因表達(dá)以及經(jīng)60Co射線輻射誘變后的新疆厚皮甜瓜酸味抗病變異株成熟果實(shí)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，該芯片平均能夠檢測(cè)新疆厚皮甜瓜基因2 008個(gè)，檢測(cè)出的基因占該芯片基因探針總數(shù)的65.4%。發(fā)現(xiàn)酸味抗病變異株上調(diào)表達(dá)的基因有251個(gè)，占檢出基因總數(shù)的12.5%，下調(diào)表達(dá)的基因224個(gè)，占檢出基因總數(shù)的11.16%。RT-PCR重復(fù)試驗(yàn)表明用Melon cDNA array ver 1.0檢測(cè)新疆厚皮甜瓜成熟果實(shí)基因表達(dá)水平是可行的。Daniel Gonzalez-Ibeas等[23]利用抗西瓜花葉病毒甜瓜材料TGR-1551，感病材料Tendral，用DNA 芯片檢測(cè)了17 443個(gè)unigenes的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)接種感染后TGR-1551比對(duì)照發(fā)生了顯著的轉(zhuǎn)錄差異，與空白對(duì)照相比，Tendral有 3 291個(gè)unigenes 差異表達(dá)，TGR-1551有2 488個(gè)unigenes 差異表達(dá)，共有677個(gè)unigene unigenes受到抑制表達(dá)。說(shuō)明TGR-1551發(fā)生了廣泛、深刻的轉(zhuǎn)錄差異。

在黃瓜上，毛偉華等[24]通過(guò)GenBank搜索已的生物代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因序列， 設(shè)計(jì)特異性引物， 采用RT-PCR法擴(kuò)增這些酶的相應(yīng)基因片段，在完成432個(gè)基因片段的克隆分離、測(cè)序和生物信息學(xué)分析工作的基礎(chǔ)上研制出國(guó)內(nèi)首張黃瓜cDNA 芯片。該芯片含有9個(gè)質(zhì)控cDN段和423個(gè)cDNA探針， 涉及光反應(yīng)、卡爾文循環(huán)、碳水化合物代謝、水-水循環(huán)、信號(hào)傳導(dǎo)、激素代謝、光呼吸、防御、蛋白與氨基酸代謝等多個(gè)代謝途徑。利用該芯片對(duì)黃瓜缺鎂脅迫下基因表達(dá)譜進(jìn)行了初步研究， 發(fā)現(xiàn)在缺鎂脅迫下差異表達(dá)的22個(gè)基因， 其中10個(gè)基因的表達(dá)受缺鎂處理抑制， 12個(gè)基因的表達(dá)受缺鎂處理誘導(dǎo)。該芯片的研制為進(jìn)一步研究黃瓜功能基因的高通量時(shí)空變化提供了有效的技術(shù)支撐。為驗(yàn)證該套cDNA芯片雜交結(jié)果的可靠性，毛偉華等[25]研究了黃瓜在CMV 侵染脅迫下的基因表達(dá)譜變化，并對(duì)其中5個(gè)具有代表性的基因通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QRT—PCR）進(jìn)行檢測(cè)，共獲得67個(gè)差異表達(dá)顯著的基因，其中42個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，25個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。這些差異表達(dá)的基因涉及了許多重要代謝途徑，許多與光合作用、氮同化相關(guān)的基因受到明顯的抑制，而一些防御相關(guān)基因和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因則誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了一些與CMV 脅迫相關(guān)的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。研究發(fā)現(xiàn)，CMV 脅迫引發(fā)了黃瓜代謝發(fā)生一系列復(fù)雜的適應(yīng)性變化，PR1-1a 等基因可能在黃瓜防御CMV侵染過(guò)程發(fā)揮著重要作用。

4 RNAi技術(shù)

RNAi（RNA interference）是一種雙鏈RNA （double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使其沉默的過(guò)程，也就是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS）。RNAi技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變體，根據(jù)表型變異可推測(cè)該基因的功能，RNAi已發(fā)展成為功能基因組學(xué)研究中基因功能鑒定的一種強(qiáng)有力的工具。

2012年，ANA M.等[26]利用RNAi技術(shù)沉默甜瓜 Cm-eIF4E（核細(xì)胞翻譯起始因子）基因，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因T2代接種8種甜瓜易侵染的病毒，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)黃瓜葉脈黃化病毒（CVYV）、甜瓜壞死斑病毒（MNSV）、摩洛哥西瓜花葉病毒（MWMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（ZYMV）產(chǎn)生抗性，表明Cm-eIF4E的存在造成甜瓜對(duì)這4種病毒的易感染性。Cm-eIF4E基因?qū)τ谔鸸献魑飶V譜高抗等位基因的發(fā)現(xiàn)，將是一個(gè)有效的選擇途徑。程鴻等[27]通過(guò)RT-PCR 方法從甜瓜中克隆得到白粉病感病相關(guān)基因CmMLO2 的cDNA 序列，RT-PCR 結(jié)果表明，CmMLO2 主要在甜瓜葉片中表達(dá)，具有組織特異性。在受到白粉病菌脅迫時(shí)CmMLO2表達(dá)顯著上調(diào)，表明CmMLO2 很有可能與白粉病發(fā)病有關(guān)。構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甜瓜，獲得了PCR 陽(yáng)性植株，對(duì)白粉病接種鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化植株對(duì)白粉病具有抗性，證明通過(guò)ihpRNAi敲除CmMLO2，可以獲得對(duì)白粉病具有抗性的甜瓜材料。

5 T-DNA插入突變

T-DNA（transferred DNA）是根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）內(nèi) Ti 質(zhì)粒（tumor-inducing plasmid）上的一段 DNA， 它能侵染并穩(wěn)定地整合到植物基因組中。由于插入的 T-DNA 序列已知， 插入到植物基因組中的T-DNA 類似于給基因貼了一個(gè)序列標(biāo)簽。通過(guò)分離T-DNA 標(biāo)簽位點(diǎn)的側(cè)翼水稻基因組序列， 可以快捷地找到含有標(biāo)簽的基因， 經(jīng)過(guò)插入標(biāo)簽基因與突變體表型的共分離檢測(cè)， 從而獲得基因的生物學(xué)功能。任海英等[28]采用農(nóng)桿菌侵染子葉外植體的方法產(chǎn)生T-DNA 插入的甜瓜突變體，篩選到一個(gè)蔓枯病抗性明顯增強(qiáng)的突變體，命名為edr2，該突變體是T-DNA 單拷貝插入甜瓜染色體引起的，edr2 的蔓枯病抗性和標(biāo)記基因卡那霉素抗性基因共分離。蔓枯病菌在突變體甜瓜edr2上的侵染過(guò)程與在野生型甜瓜上相比，分生孢子萌發(fā)率降低、芽管的伸長(zhǎng)和菌絲的生長(zhǎng)較遲緩。蔓枯病菌的侵染能引起edr2突變體發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，但是不引起野生型甜瓜的細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。本研究為選育抗蔓枯病的甜瓜品種提供了新的思路，為挖掘甜瓜-蔓枯病菌互作的基因提供了支持。

6 展 望

西瓜[29]、甜瓜[30]、黃瓜 [31]全基因組測(cè)序已完成并對(duì)外公布，測(cè)序獲得的大量生物信息為開(kāi)展功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，也標(biāo)志著瓜類作物基因組研究逐步進(jìn)入到功能基因組研究時(shí)代。可以預(yù)測(cè)，未來(lái)將會(huì)有更多不同類型的cDNA文庫(kù)，包括全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)被構(gòu)建，更多的EST序列將被釋放，從而為基因芯片的開(kāi)發(fā)提供更多的源序列。另外，TILLING 、T-DNA突變體庫(kù)的構(gòu)建工作也將陸續(xù)啟動(dòng)或完成，更多的功能基因?qū)⒈昏b定和分離。功能基因組研究的深入有望鑒定和分離出控制重要農(nóng)藝性狀的全部基因， 揭示基因的時(shí)空表達(dá)模式，弄清在性狀形成中基因與基因的互作，并在此基礎(chǔ)上形成對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。屆時(shí)人們就能夠從基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控兩個(gè)方面對(duì)基因進(jìn)行修飾，在作物育種實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)育種，從而培育出抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)良、有益人體健康的西瓜、甜瓜、黃瓜品種，滿足人們不斷增長(zhǎng)的消費(fèi)需求。

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篇4

1 rnai及rnai文庫(kù)

rnai是近年來(lái)的重大發(fā)現(xiàn)，是動(dòng)物和植物界普遍存在的一種防御反應(yīng)。rnai被細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的雙鏈rna(dsrna)所激活，可以高度特異地抑 制同源基因的表達(dá)。根據(jù)目前的研究，rnai的可能機(jī)制如下：長(zhǎng)片段dsrna在細(xì)胞內(nèi)被ⅲ型rna酶dicer切成長(zhǎng)度大約為19～23 nt的小片段干擾 rna(small interfering rna，sirna)，由sirna參與構(gòu)成復(fù)合物risc(rna-induced silence complex)。 sirna通過(guò)與同源mrna的特異配對(duì)，引 導(dǎo)risc特異地降解同源mrna，導(dǎo)致基因表達(dá)的抑制。因此小片段的sirna也可以誘導(dǎo)高效的基因沉默。

在線蟲(chóng)，注射或喂食dsrna能引起特異基因在動(dòng)物各器官的沉默，而且該抑制作用可以持續(xù)到第一代的子代動(dòng)物。但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ，通過(guò)長(zhǎng)片段dsrna直接轉(zhuǎn)染會(huì)引起細(xì)胞的毒性反應(yīng)，基因沉默效果差。近年來(lái)，陸續(xù)有用體外合成的 sirna，或用質(zhì)粒、病毒等載體在細(xì)胞內(nèi) 表達(dá) sirna達(dá)到在細(xì)胞和小鼠抑制特定基因表達(dá)的報(bào)道。

rnai文庫(kù)(rnai library)是人工構(gòu)建的能通過(guò)誘導(dǎo)rnai抑制眾多不同基因表達(dá)的混合文庫(kù)，可以用于建立功能缺陷(loss offunction) 的生物或細(xì)胞庫(kù)，進(jìn)行表型的篩選。該技術(shù)在線蟲(chóng)的應(yīng)用最為成功。在線蟲(chóng)等模式生物的研究中，應(yīng)用rnai文庫(kù)建立隨機(jī)基因抑制的線蟲(chóng)，再 進(jìn)行表型的篩選，已在其胚胎發(fā)育等領(lǐng)域取得了重要的發(fā)現(xiàn)。該文庫(kù)用含方向相對(duì)的兩個(gè)t7啟動(dòng)子的載體，可從一個(gè)隨機(jī)克隆的cdna模板分別 轉(zhuǎn)錄出長(zhǎng)片段的正義和反義rna，形成dsrna，在體內(nèi)被dicer切割成小片段的sirna，特異地抑制靶基因的表達(dá)。由于細(xì)胞外dsrna不能在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞有效地誘導(dǎo)rnai，另外，長(zhǎng)鏈dsrna(>30nt)可導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性反應(yīng)，出現(xiàn)非特異的細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡，上述轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片段dsrna 建立rnai文庫(kù)的方法不能應(yīng)用于哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞。

線蟲(chóng)等模式生物與人的差距較大，從模式生物獲得的研究結(jié)果雖然有比較重要的意義，但不能取代在人和其他高等動(dòng)物的直接研究。因 此建立可以用于人的細(xì)胞以及其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞的rnai文庫(kù)有非常重要的意義。rnai文庫(kù)將為研究基因功能、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶基因、發(fā)現(xiàn)疾病 相關(guān)基因、探索腫瘤治療新途徑等提供重要的方法。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞建立rnai文庫(kù)的方案有兩類。我們將對(duì)這兩類建 庫(kù)方案及其在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用作一介紹。

2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞已知基因rnai文庫(kù)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞已知基因rnai文庫(kù)構(gòu)建的方法如下：首先選定靶基因，根據(jù)靶基因的dna序列和sirna設(shè)計(jì)原則，合成sirna，或合成寡核 苷酸序列并克隆到表達(dá)載體，或用pcr的方法擴(kuò)增為sirna表達(dá)盒。眾多針對(duì)不同基因的sirna或 sirna表達(dá)載體或表達(dá)盒即構(gòu)成有限的rnai文庫(kù) 。應(yīng)用該文庫(kù)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以特異地抑制不同基因的表達(dá)，通過(guò)表型的篩選來(lái)發(fā)現(xiàn)功能基因，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路新分子的篩選、與腫瘤細(xì) 胞存活或轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的篩選等。

aza-blanc等應(yīng)用dharmacon公司生產(chǎn)的針對(duì)510個(gè)基因(包括了大多數(shù)激酶基因)的sirna文庫(kù)，通過(guò)轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞篩選了對(duì)trail誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡有調(diào)控作用的基因。trail是tnf家族的一員，具有抗腫瘤的功能。實(shí)驗(yàn)證明，trail蛋白能同dr4和dr5受體結(jié)合，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋 亡，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。aza-blanc等的篩選既發(fā)現(xiàn)了一些能增強(qiáng)trail誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，也發(fā)現(xiàn)了一些具有抑制作用的基因。這些基因包括以前已知對(duì)trail功能有調(diào)控作用的基因如 gsk30α和srp72，也包括一些未知的調(diào)控 基因如 dobi、mirsa等，對(duì)了解trail的作用機(jī)制和抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)有重要的意義。

berns等構(gòu)建了針對(duì)7914個(gè)基因的人rnai文庫(kù)。他們應(yīng)用了shrna(short hairpin rna)反轉(zhuǎn)錄病毒載體，每一個(gè)基因構(gòu)建了3個(gè)不同的 shrna載體，共有23742個(gè)不同的載體。用該 rnai文庫(kù)進(jìn)行基因功能的篩選，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)已知、5個(gè)未知的在p53依賴的增殖阻滯中起調(diào)控作用的 基因。進(jìn)一步的研究證明，抑制這些基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)p53和p19arf依賴的增殖阻滯以及對(duì) dna破壞誘導(dǎo)的g1細(xì)胞周期阻滯均 不敏感。 paddison等應(yīng)用shrna病毒載體，構(gòu)建了針對(duì)9610個(gè)人基因和5563個(gè)小鼠基因的shrna表達(dá)文庫(kù)。在26s蛋白酶系統(tǒng)的功能基因篩選中 ，證實(shí)該rnai文庫(kù)的實(shí)用性和可靠性。

zheng等構(gòu)建了一個(gè)雙啟動(dòng)子載體pdual。該載體包含兩個(gè)方向相對(duì)的聚合酶ⅲ啟動(dòng)子，分別為小鼠的u6啟動(dòng)子和人的h1啟動(dòng)子，中間插 入能轉(zhuǎn)錄sirna的dna序列(圖1)。該載體的優(yōu)點(diǎn)是，正義和反義rna從同一dna序列轉(zhuǎn)錄，減少了合成dna序列的長(zhǎng)度，降低了費(fèi)用和工作量。他 們巧妙地設(shè)計(jì)了能用pcr擴(kuò)增的含雙啟動(dòng)子的 sirna表達(dá)盒，并證實(shí)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效地抑制基因的表達(dá)。應(yīng)用這一技術(shù)，他們構(gòu)建了針 對(duì)8000個(gè)基因的sirna表達(dá)盒，在大規(guī)模的功能基因篩選中發(fā)現(xiàn)了一些已知和未知的在nf-kb信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用的基因。

silva等將sirna和sirna表達(dá)載體與轉(zhuǎn)染試劑混合后以微陣列的形式點(diǎn)在細(xì)胞培養(yǎng)板上，可以轉(zhuǎn)染在板上生長(zhǎng)并與之接觸的活細(xì)胞。該 技術(shù)為應(yīng)用rnai文庫(kù)進(jìn)行細(xì)胞的基因功能篩選提供了一個(gè)簡(jiǎn)單有效的方法。

上述研究均證明了有限的已知基因rnai文庫(kù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能研究中的可行性，為哺乳動(dòng)物及其細(xì)胞大規(guī)模功能基因組學(xué)的研究 提供了一個(gè)重要的技術(shù)。

已知基因rnai文庫(kù)存在以下缺陷：a．不是隨機(jī)rnai文庫(kù)，必須知道靶基因的序列，細(xì)胞基因的覆蓋面窄；b．針對(duì)每一個(gè)基因必須合成 2條以上寡核苷酸，才能確保從中選出干擾效果較好的；c．需要合成眾多的不同sirna，或構(gòu)建眾多的不同載體；d．所需費(fèi)用高，篩選的工作 量巨大。 

3 晡乳動(dòng)物細(xì)胞隨機(jī)rnai文庫(kù) 

隨機(jī)rnai文庫(kù)(random rnai library)是人工構(gòu)建的可能針對(duì)任何基因的rnai文庫(kù)。目前已報(bào)道的方法有兩種，一是通過(guò)化學(xué)合成隨機(jī) dna序列的方法，二是通過(guò)cdna酶切并克隆到載體的方法。隨機(jī)rnai文庫(kù)不需要知道靶基因的序列，因此理論上講可以構(gòu)成抑制任何基因表達(dá)的 干擾文庫(kù)，克服已知基因rnai文庫(kù)細(xì)胞基因覆蓋面窄的缺陷。該文庫(kù)同常用的基因表達(dá)文庫(kù)一樣，為不同 sirna載體的混合物，因此易于保存 ，顯著地減少了篩選的工作量。 

化學(xué)合成隨機(jī)dna序列構(gòu)成隨機(jī)rnai文庫(kù)的方法是應(yīng)用以下原理。在化學(xué)合成寡核苷酸時(shí)，如果堿基選為n，則dna合成儀在合成dna片段 時(shí)將隨機(jī)選擇a、t、g、c中的任何一種。19～21 nt的寡核苷酸如果部分或全部選為n時(shí)，則形成了眾多不同隨機(jī)序列寡核苷酸的混合物。在進(jìn) 行互補(bǔ)鏈合成并克隆到雙啟動(dòng)子rnai載體(見(jiàn)圖1的載體)后，就形成了隨機(jī)rnai文庫(kù)。 

限制性內(nèi)切酶mme i的特點(diǎn)是在dna識(shí)別序列(tccgac)下游20～21 bp處切開(kāi)dna片段。 luo等巧妙地應(yīng)用mme i的獨(dú)特特性，設(shè)計(jì)了將長(zhǎng) cdna片段酶切為20～2l nt小dna片段，克隆于sirna表達(dá)載體構(gòu)成隨機(jī)rnai文庫(kù)的方案，稱為speed。首先將隨機(jī)cdna片段與含mme i酶切位點(diǎn)發(fā) 夾結(jié)構(gòu)的dna接頭(linker)連接，再用 mme i消化，獲得20～21 bp與接頭連接的cdna小片段。將形成的雙鏈dna打開(kāi)成單鏈，合成互補(bǔ)鏈，形成 方向相對(duì)的兩個(gè)小片段cdna的拷貝，中間為不配對(duì)的形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dna序列。再克隆到反轉(zhuǎn)錄病毒載體中，構(gòu)成隨機(jī)rnai文庫(kù)。利用小鼠胚胎 cdna文庫(kù)，他們建立了含3×106克隆、可以抑制眾多不同基因的隨機(jī)rnai文庫(kù)，證明該方法的可行性。 

shirane等應(yīng)用同luo等基本相同的思路獨(dú)立地設(shè)計(jì)了構(gòu)建隨機(jī)rnai文庫(kù)的方法，稱為 epril。應(yīng)用鼠源fl5.12細(xì)胞的cdna文庫(kù)，他們建 立了隨機(jī)rnai文庫(kù)。對(duì)240個(gè)不同克隆的隨機(jī)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，215個(gè)克隆含有正確的能表達(dá)sirna的 dna片段。blast分析顯示，165個(gè)克隆的插入片段 與己知基因或est的順序相吻合，絕大多數(shù)分屬不同的基因。這一結(jié)果說(shuō)明，epril可以用于復(fù)雜基因的隨機(jī)rnai文庫(kù)的構(gòu)建。 

篇5

【關(guān)鍵詞】宏基因組學(xué)；微生物群落；遺傳物質(zhì)；口腔

【中圖分類號(hào)】Q781

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

宏基因組學(xué)認(rèn)為，生命研究的對(duì)象應(yīng)是生物環(huán)境中全部微小生物的基因組，即特定環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和。它包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因總和，微生物主要包括環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌；因此，宏基因組學(xué)就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系以及與環(huán)境之間的關(guān)系等為研究目的的新的微生物群落研究方法，也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)或生態(tài)基因組學(xué)。

利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究口腔微生物，無(wú)需單一分離培養(yǎng)某一種類的微生物，即可直接在基因水平上研究口腔微生物，包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物。宏基因組學(xué)應(yīng)用于口腔微生物的研究，主要包括兩個(gè)方面：一方面進(jìn)行微生物生態(tài)學(xué)研究，從整體微生物群落水平來(lái)研究口腔微生物，揭示口腔微生物群落多樣性及其變化；另一方面是進(jìn)行口腔微生物及其基因的研究，從中篩選到新的功能基因及其產(chǎn)物。通過(guò)這兩方面的研究，較全面地了解口腔微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能基因組，為深入探索口腔微生物的代謝活動(dòng)，最大限度地發(fā)掘口腔微生物資源提供可能。

1　宏基因組學(xué)的研究方法

宏基因組學(xué)是從特定環(huán)境中直接分離所有微生物的DNA，選擇合適的載體用于克隆DN段，將DN段克隆到宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，根據(jù)某些生物活或基因序列篩選有價(jià)值的克隆并進(jìn)行其功能分析。

1.1宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建

1.1.1環(huán)境微生物DNA的提取　環(huán)境樣品DNA的提取是基因組文庫(kù)構(gòu)建中最重要的一步，不僅要盡可能地將環(huán)境中所有微生物的DNA提取出來(lái)，而且還要保證一定的DN段長(zhǎng)度和完整性。根據(jù)提取樣品總DNA前是否需要分離細(xì)胞，可將其提取方法分為原位裂解法和異位裂解法。原位裂解法可直接破碎樣品中的微生物細(xì)胞而使其DNA得以釋放。原位裂解法無(wú)需對(duì)樣品微生物進(jìn)行復(fù)蘇，黏附顆粒上的微生物細(xì)胞亦能被裂解，所得DNA能更好地代表微生物的多樣性。由于原位裂解法所提取的DN段僅為1～50kb，故其通常用于構(gòu)建小片段插入文庫(kù)（以質(zhì)粒或入噬菌體為載體）的DNA提取。異位裂解法則先采用物理方法將微生物從樣品中分離出來(lái)，然后以較溫和的方法抽提其DNA。此法提取可以獲得長(zhǎng)度為20～500kb的大片段DNA，而且純度高，但卻容易丟失微生物物種信息。該方法適用于構(gòu)建大片段插入文庫(kù)（以黏粒或細(xì)菌人工載體為載體）的DNA提取。

1.1.2載體選擇　目的基因能否有效地轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞并在其中高表達(dá)，在很大程度上取決于載體。通常用于DNA克隆的載體包括質(zhì)粒、黏粒和細(xì)菌人工染色體（bacterial　artificial　chromosome，BAC）等。質(zhì)粒一般用于克隆小于10kb的DN段，適用于單基因的克隆與表達(dá)。黏粒又稱柯斯質(zhì)粒或柯斯載體，用于克隆大片段的DNA分子，其克隆外源DN段的極限高達(dá)350kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)質(zhì)粒載體的克隆能力。BAC用于克隆150kb左右大小的DN段，最多可保存300kb個(gè)堿基對(duì)，轉(zhuǎn)化率高，而且其以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在于細(xì)菌體內(nèi)，易于分辨和分離純化。另外，構(gòu)建能容納40kb外源DNA插入片段的fosmid文庫(kù)也有報(bào)道。

1.1.3宿主選擇　目前，常用的宿主主要有大腸埃希菌以及鏈霉菌屬或假單胞菌屬。一些缺陷型突變體細(xì)菌也可以作為宿主進(jìn)行宏基因組文庫(kù)的功能篩選。宿主的選擇主要應(yīng)考慮其轉(zhuǎn)化率和宏基因表達(dá)以及重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和目標(biāo)性狀的篩選等。對(duì)于任何宏基因組來(lái)源的基因來(lái)說(shuō)，大腸埃希菌依然是最理想的克隆和表達(dá)宿主。也可以用其他宿主菌，例如被用來(lái)鑒定與新抗生素生物合成相關(guān)基因的淺青紫鏈霉菌和一些革蘭陰性細(xì)菌。也可以用穿梭黏粒或BAC載體將構(gòu)建于大腸埃希菌的文庫(kù)轉(zhuǎn)入其他宿主，如鏈霉菌屬或假單胞菌屬中。根據(jù)不同微生物產(chǎn)生活性物質(zhì)的差異和研究目標(biāo)的不同，選擇不同的宿主。隨著技術(shù)的成熟和新宿主的選擇，基因篩選率和功能基因檢測(cè)率得以提高，進(jìn)而宏基因組文庫(kù)的目標(biāo)基因的表達(dá)也得以提高。

1.2宏基因組文庫(kù)的篩選

根據(jù)研究目的，宏基因組文庫(kù)的篩選通常有功能篩選和序列篩選兩種方法。功能篩選最常用方法是根據(jù)重組克隆產(chǎn)生一些酶蛋白功能活性，采用各種檢測(cè)手段，挑選活性克隆子，得到完整的功能基因和帶有目的基因的基因簇，發(fā)現(xiàn)全新的基因或活性物質(zhì)。功能篩選首先要求功能基因或帶有目的的基因簇在宿主中表達(dá)，但因其受到檢測(cè)手段的限制，往往是在數(shù)千個(gè)甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)重組克隆子中才能檢測(cè)到有用的活性克隆。序列篩選是依賴于目的基因的保守DNA序列，以序列相似性為基礎(chǔ)，執(zhí)行某類功能的酶可能具有相似的基因序列，根據(jù)已有的序列信息設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增或雜交篩選陽(yáng)性克隆子。序列篩選一般只能獲得結(jié)構(gòu)基因的片段，而不能獲得完整的功能基因；但是，它可以將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)志并將其作為探針篩選宏基因文庫(kù)，以獲得完整的功能基因。用這種方法有可能篩選到某一類結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)中的新分子。

宏基因組文庫(kù)的篩選除了功能篩選和序列篩選法外，還可以采用底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法（sub-strate-induced　gene　expression，SIGEX）。SIGEX是以代謝相關(guān)基因或酶基因往往有底物存在的條件下才表達(dá)，反之則不表達(dá)的原理來(lái)篩選目的代謝基因的。SIGEX的優(yōu)點(diǎn)在于它為高通量篩選提供了保障，而且不需要對(duì)底物進(jìn)行修飾。

2　宏基因組學(xué)在口腔微生物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1口腔微生物群落結(jié)構(gòu)分析

口腔是一個(gè)由大量微生物組成的復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，人類口腔中寄居著大約700多種細(xì)菌。人類口腔適宜的溫度、濕度，豐富的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和理化性質(zhì)的不同，為口腔內(nèi)各種微生物的生長(zhǎng)、繁殖和定居提供了非常適宜的環(huán)境，因而也就造就了口腔微生物群的多樣性。口腔微生物大部分可以相互關(guān)聯(lián)并形成生物膜，抵抗機(jī)械清除力或抗生素治療，但是在環(huán)境變化或其他口腔情況（如個(gè)人口腔衛(wèi)生質(zhì)量）變化觸發(fā)時(shí)，它們也可成為致病微生物。

菌斑指示劑和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法以及常規(guī)的PCR特異性擴(kuò)增的分子生物學(xué)方法在某種程度上都不能完整地反映整個(gè)微生物群落的組成和動(dòng)態(tài)變化，不適合用其研究復(fù)雜的口腔微生物群落。此外，在難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物當(dāng)中，可能也有致病菌匿藏其中，因而也不能有效地用其研究與病程相關(guān)的微生物。

隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在基因組學(xué)的基礎(chǔ)上誕生了宏基因組學(xué)這一門嶄新的交叉學(xué)科。宏基因組學(xué)是繼發(fā)明顯微鏡以來(lái)研究微生物最重要的進(jìn)展，將為微生物世界帶來(lái)革命性的突破。Turnbaugh等利用16S　rRNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)：胖人和瘦人的內(nèi)臟中有著不同的微生物菌群；當(dāng)胖人減肥的時(shí)候，他們內(nèi)臟中的細(xì)菌群基因也同樣發(fā)生變化，更加接近瘦人內(nèi)臟中的細(xì)菌群。

基于常規(guī)的口腔細(xì)菌培養(yǎng)方法和細(xì)胞學(xué)顯微鏡檢查，目前公認(rèn)變異鏈球菌和乳酸桿菌等是引起齲病的主要致病菌；但是，隨著宏基因組學(xué)在微生物的種類和多樣性研究中的應(yīng)用，有關(guān)齲病是由單一細(xì)菌引起或是由生物膜中的多種細(xì)菌引起的定論面臨質(zhì)疑。目前普遍認(rèn)為，齲病并不是僅由變異鏈球菌或其他任何一種菌斑中的細(xì)菌單獨(dú)引起的，而是由各種產(chǎn)酸菌相互作用的結(jié)果。

Aas等在對(duì)51名齲患者的1285個(gè)菌斑細(xì)菌的16S　rRNA序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，50％的細(xì)菌不能識(shí)別，一些新的細(xì)菌菌種與齲病的發(fā)生有關(guān)。Keijser等在用焦磷酸測(cè)序法分析健康人涎液和牙菌斑中細(xì)菌群時(shí)發(fā)現(xiàn)，口腔微生物具有多樣性。即他們從98名健康成人口腔中取得的牙菌斑就由1萬(wàn)個(gè)微生物表型組成，其種族數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)之前報(bào)道的通過(guò)培養(yǎng)或者傳統(tǒng)克隆和測(cè)序技術(shù)定義的700種口腔微生物表型。

Zaura等在利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了3名健康高加索人口腔內(nèi)5個(gè)部位的微生物組后發(fā)現(xiàn)，在健康人的口腔中微生物有3600種獨(dú)特物序列，超過(guò)500種不同的分類單元或“物種級(jí)”表型和88～104種高級(jí)分類群，每個(gè)單獨(dú)的樣品平均藏匿有266種分類單元。從這3名個(gè)體微生物組的測(cè)序結(jié)果分析可知，高級(jí)分類群、分類單元和獨(dú)特序列都有一個(gè)較大的重疊，即84％的高級(jí)分類群、75％的分類單元和65％的獨(dú)特序列至少在這3個(gè)微生物組中的2個(gè)組中存在。這3名個(gè)體的總共6315個(gè)獨(dú)特序列中有1660個(gè)相同序列，這1660個(gè)相同序列，即“核心微生物組”貢獻(xiàn)了66％的測(cè)序內(nèi)容，重疊的分類單元貢獻(xiàn)了94％的內(nèi)容，而幾乎所有的內(nèi)容（99.8％）都屬于共享的高級(jí)分類群。

研究證實(shí)，在不同的健康人的口腔微生物中，大部分微生物組是相同的，提示可能存在健康口腔核心微生物組。Kanasi等在對(duì)80名患齲和無(wú)齲嬰幼兒牙菌斑微生物的16S　rRNA序列克隆分析中發(fā)現(xiàn)，兩者之間存在著139種不同微生物。Gross等通過(guò)酶促法測(cè)序技術(shù)對(duì)無(wú)齲和患齲年輕恒牙牙菌斑微生物的16S　rRNA序列進(jìn)行分析后認(rèn)為，齲齒中產(chǎn)酸菌除了變異鏈球菌和乳酸桿菌外，月形單胞菌、奈瑟菌和緩癥鏈球菌同樣是潛在的產(chǎn)酸細(xì)菌。Willner等等在利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了19名健康人口腔咽部的病毒宏基因組序列后發(fā)現(xiàn)，口腔咽部是一個(gè)潛在的被噬菌體T3侵蝕的腸道菌儲(chǔ)存庫(kù)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)了編碼血小板凝集因子PblA和PblB的兩個(gè)寄生于變異鏈球菌中的噬菌體sm-1基因，而之前有研究稱在心內(nèi)膜上發(fā)現(xiàn)了變異鏈球菌。這說(shuō)明，口腔中的病毒與心臟疾病存在潛在的聯(lián)系。

宏基因組學(xué)技術(shù)可以避開(kāi)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，在DNA水平來(lái)探討口腔微生物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境微生物的關(guān)系。微生物多樣性在基因水平上主要表現(xiàn)為基因組大小和基因數(shù)目的多樣性，遺傳物質(zhì)化學(xué)組成的多樣性和某些特異性序列的差異。宏基因組技術(shù)為研究口腔微生物復(fù)雜群落和多樣性提供了重要的技術(shù)手段，通過(guò)快速可靠地獲得口腔微生物中各種微生物的菌落指紋和特征性核苷酸序列，以系統(tǒng)分析口腔微生物的多樣性及其分類地位，發(fā)掘豐富的口腔微生物資源。

2.2口腔微生物宏基因組文庫(kù)中的新型基因篩選及其功能

宏基因組學(xué)除了研究微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能外，還可用于發(fā)現(xiàn)新的基因和開(kāi)發(fā)新的微生物活性物質(zhì)。Jiang等構(gòu)建土壤宏基因文庫(kù)，成功地克隆和鑒定出一種新型的β-葡萄糖苷酶基因，該基因包含一個(gè)由151個(gè)氨基酸編碼組成的多肽。該研究對(duì)深入挖掘土壤未培養(yǎng)微生物的β-葡萄糖苷酶基因資源和該基因功能具有的重要意義。陳春嵐等從富集培養(yǎng)物宏基因組文庫(kù)中篩選出一個(gè)表達(dá)木聚糖酶基因umxyn10B，該基因大小為999bp，編碼產(chǎn)物的氨基酸序列具有較好的同源性。對(duì)其功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該酶具有優(yōu)良的理化特性，可廣泛應(yīng)用于食品、能源、造紙和紡織等行業(yè)。Yu等利用宏基因功能篩選發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)新型低溫活性酶脂EstM-N1和EstM-N2，屬于細(xì)菌脂肪分解酶Ⅷ家族成員。這一發(fā)現(xiàn)將推動(dòng)生物催化劑的應(yīng)用。

當(dāng)前，宏基因組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在微生物學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，尤其是在發(fā)現(xiàn)具有潛在應(yīng)用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物方面顯示出了無(wú)窮的魅力，但是，利用宏基因組技術(shù)探索口腔微生物的新的功能基因尚處于起步階段。Warburton等對(duì)口腔細(xì)菌群體中的耐藥基因進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的耐四環(huán)素基因tet32能夠使四環(huán)素失活。雖然對(duì)口腔微生物新的功能基因及其功能研究還太少，但依然可以借助宏基因組學(xué)技術(shù)發(fā)掘新基因，以利用這些新基因在口腔醫(yī)學(xué)行業(yè)發(fā)揮應(yīng)有的作用。